Скачать

Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов

Обзор посвящен современным концепциям и данным, свидетельствующим о целостном характере микробных популяций (колоний, био-плёнок и др.) как своеобразных "суперорганизмов". При этом особое внимание уделяется таким явлением как апоптоз, бактериальный альтруизм, эффект кворума, коллективная дифференцировка микробных клеток, формирование структур колониального уровня типа внеклеточного матрикса, а также способам и конкретным агентам межклеточной коммуникации в микробной популяции. Подчёркивается эволюционно-консервативный характер многих средств коммуникации и форм межклеточных взаимодействий, а также роль колониальной организации и межклеточной коммуникации в системах "паразит/комменсал/симбионт –многоклеточный организм-хозяин".

This review covers the modern concepts and recent data demonstrating the integrity and coherence of microbial populations (colonies, bio-films, etc.) as peculiar "superorganisms’. Special attention is given to such relevant phenomena as apoptosis, bacterial altruism, quorum effects, collective differentiation of microbial cells, and formation of population-level structures such as extracellular matrix. Emphasis is placed on the channels and agents of intercellular communication in a microbial population. The involvement of a large number of evolution-conserved communicational facilities and patterns of intercellular interactions is underscored. Much attention is also given to the role of colony organization and intercellular communication in "parasite/commensal/symbiont-multicellular host organism" systems.

Настоящая работа посвящена данным о том, что бактерии и эукариотические одноклеточные организмы существуют в виде целостных структурированных колоний. Подобно колониям многоклеточных животных (кишечнополостных, мшанок) и семьям социальных насекомых и некоторых млекопитающих (бесшерстных кротов), микробные колонии вполне заслуживают название "суперорганизмы". Микробные колонии характеризуются функциональной специализацией слагающих их клеток и предоставляют этим клеткам ряд преимуществ "социального образа жизни", таких как повышенная устойчивость к антибактериальным агентам, более эффективное использование питательных субстратов, особенно в пространственно ограниченных экологических нишах, включая организм многоклеточного животного (растения) как хозяина. Микробные колонии как целостные структуры стали модным предметом исследований в 90-е годы (см. например (1)), однако нельзя забывать разработки на эту тему классиков микробиологии. Корифей отечественной микробиологии И.Д. Иерусалимский фактически предварил сегодняшние дискуссии на тему организации микробных колоний (плёнок, зооглей, флоков и др.), возражая в своей докторской диссертации (2) против примитивного органицизма – прямолинейного уподобления микробной колонии многоклеточному организму (здесь мы опираемся на комментатора И.Д. Иерусалимского Е.Л. Головлева (3)). Положения работ Иерусалимского скорее соответствовали представлению о микробной колонии как надорганизменной (биосоциальной) системе (4, 5), которая, подобно социумам муравьев или даже млекопитающих, характеризуется:

• пространственной обособленностью микроколоний каждого вида ("микробных муравейников") в естественных местообитаниях;
• фенотипической гетерогенностью культуры как основой для дифференциации клеток по социальным ролям;
• целостностью культуры в процессе развития, наличием у ней интегральных свойств, отсутствующих у отдельных индивидов;
• способностью колонии влиять на характеристики окружающей среды при достаточной плотности популяции (это свойство ныне отражено в понятии "кворума" – см. ниже).

В работах 80-х годов С.Г. Смирнов высказывает по сути аналогичные взгляды, рассматривая микробную колонию как "пространственно-временной континуум", состоящий из "клеточных кластеров" с различающимися свойствами. Причём, на каждом этапе развития культуры доминирует свой субколониальный кластер (6).

Тема микробной колониальной организации уже разрабатывалась авторами в предшествующих статьях (3, 4, 7), однако настоящая работа привлекает новейшие данные и соответственно расширяет список охватываемых в обзоре рубрик за счёт таких популярных в последние годы направлений исследований как бактериальный апоптоз и альтруизм, эффекты кворума и др.

В последние годы опубликован ряд серьёзных обзорных работ по микробной колониальной организации и био-коммуникации (см., например, (1, 8-16)), однако недостаточно разработанными в литературе остается вопрос о роли эволюционно-консервативных (т. е. химически идентичных или явно гомологичных у различных форм живого) сигнальных молекулах, выступающих как факторы межклеточной коммуникации и социального поведения, а у многоклеточных животных и растений также и в более специализированных ролях (гистогормоны, гормоны, нейромедиаторы). На эволюционно-консервативный характер многих сигнальных молекул ранее обратил внимание А. М. Уголев, обосновывая свою теорию эволюции живого "на основе комбинирования ограниченного числа универсальных функциональных блоков" (17, С. 143). Для Уголева химические сигналы и рецепторы к ним представляли яркий пример подобных функциональных блоков, которые близки или идентичны у организмов на разных уровнях биологической эволюции.

Из доступных нам работ по микробной коммуникации, существенное внимание к эволюционно-консервативному характеру сигнальных молекул уделяется в работах А.С. Капрельянца с соавт. (см. обзор (14)). Тем не менее, авторы делают основной упор только на белковые/пептидные сигнальные вещества, которые они называют цитокинами по аналогии с внутриорганизменными информонами животных. Настоящая работа поэтому (отдавая дань пептидам и белкам), уделяет значительное внимание непептидным факторам коммуникации, среди которых, наряду с уникальными для микроорганизмов, имеются и разнообразные эволюционно-консервативные агенты, в том числе нейромедиаторы (по функции у многоклеточных животных), которым посвящены собственные исследования авторов (18, 19). Настоящий обзор также исследует вопрос о роли колониальной организации и межклеточной (особенно плотностно-зависимой) коммуникации во взаимодействиях симбиотической (паразитической) микробиоты и макроорганизма-хозяина.

Форма и структура микробных колоний

Происходящая в настоящее время постепенная смена микробиологической парадигмы – переход от представлений об одноклеточности микроорганизмов к представлению о микробных колониях как целостных "сверхорганизмах" – находит своё отражение в нарастающем интересе к форме, рисунку, макро- и микроструктуре бактериальных колоний. "Колонии практически всех прокариотических видов демонстрируют способность к клеточной дифференцировке и многоклеточной организации. Эта способность, конечно, имеется у бактерий и в их природных местообитаниях, где они в основном существуют в виде био-плёнок, цепочек, матов и микроколоний." (1, p.598). В современной микробиологии как бы тем самым намечается постепенный переход к биосоциальному ("биополитическому" (3, 4, 19, 20)) подходу к микроорганизмам, чему способствует детальный анализ межклеточных (межпопуляционных) взаимодействий с помощью генетической инженерии, поточной цитофлуориметрии, сканирующего электронного микроскопа, цейтраферной видеосъёмки и т. д.

Многочисленные работы по колониальной организации микроорганизмов свидетельствуют о морфологической и физиологической гетерогенности входящих в её состав клеток. Колония как бы сложена из нескольких различных "тканей" (1, 21) – клеточных кластеров в понимании С.Г. Смирнова (6). В качестве типичных кластеров у шигелл он рассматривал 1) активно делящиеся; 2) покоящиеся и 3) спонтанно автолизирующиеся клетки (17). Хорошо известны сходные данные работ А.С. Капрельянца с сотрудниками. Так, популяция голодавшей в течение 3-6 месяцев бактерии Micrococcus luteus состояла из живых, покоящихся и нежизнеспособных клеток, как показывает исследование с помощью клеточного сортера (по связыванию родамина 123) и в бифазной системе водных растворов полимеров (14, 22-24).

Имеется как вертикальная слоистость колонии, так и наличие в ней горизонтально разделённых зон (секторных и концентрических). Вертикальные слои хорошо заметны при наблюдении окрашенных (толуидиновая синяя, метиленовая синяя) срезов колоний. Так, в колониях Escherichia coli (1, 25) иShigella flexneri (21) обнаружены три слоя: 1) нижний окрашенный (толщиной 6 мкм в исследованной колонии E. coli (25)); 2) средний, в основном светлый, по-видимому, сложенный из нежизнеспособных клеток (часто неправильной формы (21)), в который погружены отдельные хорошо прокрашенные жизнеспособные клетки; толщина этого слоя у E. coli – 16 мкм (25); 3) верхний окрашенный (40 мкм у E. coli), в котором в случае E. coli хорошо заметна дальнейшая дифференциация на два слоя – более нижний тонкий (толщиной 1-3 клеточных слоя), с чёткой границей и особенно ярко окрашенный и толстый слой (40 мкм у E. coli), содержащий отдельные не окрашенные клетки (25). Интересно, что окраска на β-галактозидазу при использовании генноинженерных штаммов E. coli с геном lac Z даёт в целом сходную картину: узкий слой β-галактозидазосодержащих клеток, прилегающих к субстрату, сменяется (по мере движения вверх) слоем клеток без β-галактозидазы, выше которого лежат β-галактозидазосодержащие клетки. Самый верхний слой колонии имеет смешанное строение, включающее группы β-галактозидазосодержащих клеток и клетки, не содержащие этот фермент (25). Слои из морфологически и биохимически различающихся клеток наблюдали в колониях возбудителя холеры Vibrio cholera ещё в 1920 г. (26).

Многие исследователи отмечают в своих работах наличие в колониях также системы воздухоносных микрополостей, часто пересечённых "балками" из клеточных тяжей. Сложная система микрополостей фактически превращает колонии в совокупность частично изолированных друг от друга очагов сгущения (микроколоний). Микроколонии, сформированные слизистым матриксом и разделённые открытыми (часто заполняемыми водой) каналами, характерны также и для внутренней структуры био-плёнок. Это своего рода аналог примитивной "циркуляторной системы", доставляющей питательные субстраты и убирающей продукты метаболизма (27). В колониях бактерии Alcaligenes sp., штамм d₂, обнаружены поры и каналы, а также более специализированные структуры ("газовые баллоны"), окруженные своеобразной "мембраной" и содержащие внеклеточные гемопротеины. Предположительно, такие структуры способствуют транспорту О₂ к клеткам в колониях (агрегатах), т. е. речь идёт об аналоге дыхательной системы органов (28-30).

Уже отмечено, что помимо вертикальной слоистости, колониям микроорганизмов на плотных средах свойственны также секторные и концентрические зоны. Сектора соответствуют генетически различающимся клонам, что находит своё отражение в их различной окраске, консистенции, форме, скорости роста, активности ферментов и др. Наглядный пример – фазовая диссоциация бактерий на R-, S- и М-формы, различающиеся толщиной клеточной стенки (так, у представителей бруцелл толщина клеточной стенки у R-варианта больше, чем у S-варианта (31)), наличием или отсутствием микрокапсулы, характеристиками фибриллярного (R- и S-варианты) или везикулярно-тубулярного (М-вариант) межклеточного матрикса и др. Фазовые диссоцианты обусловливают различие в архитектонике секторов колоний. В S-варианте клетки родококков распределены по толщине колонии равномерно, число контактирующих между собой клеток невелико (31). Что касается R-варианта, то в соответствующем секторе клетки нижних слоёв располагаются перпендикулярно или под углом к питательной среде, клетки верхних слоёв – радиально и параллельно к поверхности агара. В М-секторе клетки лежат крупными группами и не контактируют между собой (32).

Концентрические зоны отражают стадии "онтогенеза" бактериальных клеток – они соответствуют различным этапам программ индивидуального развития клеток. Сектора могут быть выявлены (например, у E. coli на минимальной синтетической питательной среде М9) простым визуальным наблюдением (33). На агаризованной среде с триптоном и глюкозой концентрические круги могут быть выявлены при добавлении в агар 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого, который восстанавливается клетками некоторых (не всех) секторов до окрашенного в красный цвет формазана. В результате колония оказывается состоящей из белых и красных концентрических колец (33). Шапиро (1, 34) визуализировал эти кольца у E. coli, на индикаторной среде, позволяющей выявить наличие или отсутствие у клеток b -галактозидазной активности (как описано выше, различия по этому параметру имеются и между вертикальными слоями клеток в колонии).

Если на пути распространяющейся бактериальной колонии создают механическое возмущение, например, помещают стеклянные волокна (в естественных местообитаниях роль препятствий могут играть, например, складки и крипты в кишечнике как экологической нише для микробиоты), то возникает лишь локальное изменение в соответствующих концентрических кольцах, которые всё равно не теряют своей непрерывности. Когда препятствие остается позади фронта колонии, кольца формируются за этим препятствием по тем же геометрическим законам, что и в других участках колонии (35). Немеханическое по своей природе возмущение для нормального развития колонии создаётся в том случае, если клетки несут мутацию по важному для онтогенеза гену. Так, мутант E. coli с повреждённым (путём инсерции) геном ДНК-полимеразы I в первые часы развития формирует аномальные микроколонии из нитевидных клеток. Однако, и в этом случае колония находит пути преодоления дефекта: через 2-4 дня мутанты колонии становятся морфологически неотличимыми от нормальных колоний, клетки – от клеток дикого типа (36). Преодоление генетического дефекта существенно ускоряется, если по соседству имеются зрелые (возраст 2 дня) нормальные колонии, которые, по-видимому, выделяют диффундирующие химические факторы коммуникации (36). Более старые колонии заставляют более молодые, также в результате воздействия коммуникативных агентов, "подстраивать" свой возраст под возраст "старших" – например, формироватьвнешние концентрические кольца без предварительного формирования внутренних колец (1) (подробнее о коммуникации у микроорганизмов см. соответствующий раздел обзора).

Если концентрическая зональность колонии сочетается с секторной, то у более быстро растущих секторов концентрические кольца как бы оттянуты к краю (34), т.е. формирование колец регулируется не в пространстве (путем взаимодействия соседних клеток), а во времени (пульсации "биологических часов"). Последнее наиболее очевидно для видов бактерий (например, для представителей р. Proteus, Serratia и Salmonella, для E. coli), периодически формирующих швермеры (37) -- клетки с избыточным количеством жгутиков и не способные к делению. Швермеры формируют колониальную структуру из концентрических террас в результате чередования следующих процессов: 1) рост и деление вегетативных клеток (лаг-фаза перед очередным формированием швермеров); 2) массовое формирование центробежно мигрирующих швермеров; 3) превращение швермеров в вегетативные клетки с формированием очередной "террасы" (стадия консолидации) (38).

Полученные данные о зависимостиритма "биологических часов" от плотности клеточной популяции, в частности, о связи между плотностью инокулята Proteus mirabilis и продолжительностью лаг-фазы перед появлением первой "волны" швермеров, указывает на наличие сложной системы внутриколониальной коммуникации. У Serratia liquefaciens идентифицирована природа химического сигнального агента, представляющего собой ацилированное производное лактона гомосерина (39) (класс распространенных сигнальных молекул грамотрицательных бактерий, см. ниже). По мере развития колонии имеется тенденция ко всё большей синхронизации поведения отдельных клеток со всё более совершенной циркулярной симметрией колонии в целом, вопреки возмущающим факторам (40). Эта тенденция к синхронному поведению сохраняется при снижении концентрации глюкозы как питательного субстрата и при повышении концентрации агар-агара в среде. В последнем случае снижается скорость перемещения швермеров, чьи жгутики нуждаются в капельно-жидкой влаге, поглощаемой ими из агарового геля с помощью специального полисахарида капсулы (40, 41). У Serratia marcescens сами клетки вырабатывают увлажняющий циклический липопептид (42). Существует генетический триггер, переключающий клетки с синтеза белков поздних стадий клеточного деления на синтез белка жгутиков (флагеллина) и таким образом детерминирующий взаимопревращение швермеров и делящихся вегетативных клеток (43).

С точки зрения колониальной организации интересен тот факт, что по агару, ещё не занятому растущей колонией, могут перемещаться только целые группы швермеров. Одиночные клетки, вышедшие за пределы колонии, теряют подвижность до тех пор, пока их не "подхватит" та или иная группа швермеров (1). Это наблюдение указывает на координацию поведения в масштабе каждой группы. Помимо этого, хорошо известна также координация миграции швермеров в масштабе всей колонии. Таким образом, в колонии бактерий имеется по крайней мере два уровня интеграции:
1) отдельная группа координированно мигрирующих швермеров и 2) вся колония, включающая много подобных групп. Имеется аналогия с организмом многоклеточных существ, где также известны как координирующие системы внутритканевого уровня (паракринные системы), вырабатывающие локально действующие гистогормоны (гистамин, серотонин и др.), так и генерализованные системы на уровне целого организма (нервная и эндокринная системы) (44).

Для колоний микроорганизмов, как и для многих других биосоциальных систем, характерно формирование функциональных органов надорганизменного уровня, принадлежащих целой системе и коллективно используемых всеми её элементами (индивидами). Наиболее примечателен факт слияния индивидуальных наружных клеточных покровов (капсул, экстракапсулярной слизи и др.), что ведёт к образованию единого биополимерного матрикса . В состав матрикса входят кислые полисахариды, гликозилфосфатсодержащие биополимеры типа тейхоевых кислот, гликопротеины, у некоторых бактерий (например, бацилл) также полиглутаминовая кислота и др. биополимеры (41). Подобно межклеточному матриксу животных тканей, микробный матрикс также включает фибриллярные элементы (45). Сходство между животным и микробным матриксом дополняется общностью некоторых химических компонентов (примером служат сиаловые кислоты). Как "функциональный орган" микробной колонии, матрикс микроорганизмов выполняет роли, относящиеся к надклеточному уровнюорганизации:

• Структурообразующую роль. Благодаря матриксу колония состоит, строго говоря, не из одиночных клеток, а из субколониальных ассоциаций, которые встречаются и у грамположительных, и у грамотрицательных бактерий (в том числе – у патогенных видов обоих этих групп) и особенно бросаются в глаза при электронно-микроскопическом наблюдении капсулированных бактерий, например, клебсиелл (46). К структуре колоний относятся также полые трубочки из внеклеточных полисахаридов и других биополимеров (скажем, в колониях Pseudomonas aeruginosa) – предполагаемые микроканалы для транспорта веществ. Помимо этого, через подобные трубочки мигрируют клетки колоний, обычно в виде мелких L-форм (47). Подобные "отстрелы", в частности, характерны для видов бактерий, входящих в состав симбиотической микробиоты человека и животных (47).
• Защитную (протекторную) роль. Обволакивающий клетки матрикс выступает как буферная внутренняя среда колонии, предохраняющая отдельные клетки и колонию в целом от неблагоприятных воздействий извне (высыхание, нагревание/охлаждение, атака гидролитических ферментов и др.). Полисахаридные и пептидные компоненты матрикса, в частности, включают в себя ряд крио-, термо- и ксеропротекторов (48).
• Коммуникативную роль. В матрикс выделяются и по нему распространяются экзометаболиты и продукты автолиза клеток, включая химические сигнальные вещества, в том числе служащие для оценки плотности собственной популяции (см. ниже). В ряде случаев сигнальные вещества присутствуют в супернатанте микробной культуры лишь в незначительных концентрациях, поскольку задерживаются в матриксе, где и выполняют свою функцию; здесь необходимо подчеркнуть, что многие виды бактерий сохраняют надклеточную организацию и, соответственно, внеклеточный матрикс и при культивировании на жидких средах.

Подобно эукариотическим клеткам в составе тканей многоклеточного животного, растительного или грибного организма, прокариоты формируют внутриколониальные межклеточные контакты, вероятно, способствующие распространению сигнальных молекул в популяции, особенно если речь идёт о недиффундирующих в среде факторах коммуникации (см. ниже). Межклеточные контакты формируются за счёт многообразных поверхностных структур, включая микрофибриллы, шишковидные выступы, эвагинаты клеточной стенки, гликокаликс, отражая "генетически детерминированную закономерность развития микробных популяций как саморегулирующихся многоклеточных систем" (49, С.222).

Таким образом, структура колоний микроорганизмов служит зримым отражением её сложной многоуровневой социальной организации, включающей коллективные, охватывающие всю колонию формы поведения, когда "воля индивида" (клетки) подчиняется "воле коллектива".Поистине, "бактерии, хотя и представляют собой одноклеточные организмы, являются социальными существами, которые формируют многоклеточные ассоциации" (8, p.184).

Микробный апоптоз и альтруизм

Яркий пример социального контроля (на уровне колонии) за микробными клетками – апоптоз, т.е. программированная гибель отдельных клетокв интересах популяции в целом. Явление апоптоза ранее изучено на животных и, в меньшей мере, на растительных клетках. В этих случаях апоптоз – нормальная составная часть индивидуального развития организма. Так, он необходим для резорбции хвоста при превращении головастика; развитие мозга предполагает программированную гибель некоторых нейронов, причём мутация, предотвращающая апоптоз клеток эмбрионального мозга, является летальной. Апоптоз растительных клеток, пораженных инфекционным агентом, предотвращает дальнейшее распространение инфекции. Интенсивно исследуются генетико-биохимические механизмы апоптоза, связанные с активацией каскада каспаз (эволюционно консервативных цистеиновых протеаз), отвечающих в конечном счёте за активацию нуклеаз и ферментов, разрушающих другие клеточные структуре (50, 51). Интересно, что апоптоз животных клеток фактически может происходить при участии симбиотических потомков бактерий – митохондрий. Повреждение стрессорными факторами мембран митохондрий, угрожающее не только самой клетке, но и её соседкам накоплением токсических свободно-радикальных форм кислорода, узнаётся клеткой по выходу из митохондрий цитохрома с. Этот цитохром связывается цитоплазматическим белком Apaf1, который связывает прокаспазу-9, превращая её в активную каспазу-9. Так инициируется каскад каспаз и апоптоз (50, 51).

Что касается апоптоза у микроорганизмов, то это явление находится в стадии исследования. Достаточно хорошо изучена система эукариотического микроорганизма – миксомицета Dictyostellium discoideum. Трансформация D. discoideum из одноклеточных амёб в многоклеточный мигрирующий псевдоплазмодий и далее в плодовое тело со спорами представляет собой коллективную реакцию на голодание клеточной популяции (система рассмотрена нами ранее в обзорах (4, 5)). Когда многоклеточный псевдоплазмодий начинает строить плодовое тело, клетки в его передней четверти претерпевают апоптоз. Мёртвые клетки формируют ножку плодового тела (52, 53). Процесс находится под контролем ряда сигнальных агентов. Генерализованным агентом коммуникации служит циклический аденозиномонофосфат, но для дифференциации клеток ножки (с апоптозом) особенно важен фактор DIF (1-(3,5-дихлоро-2,6-окси-4-метоксифенил)-1-гексанон) (52, 53). У миксобактерий – прокариотических аналогов миксомицетов в плане жизненного цикла – также наблюдается программированная гибель многих клеток во время агрегации миксобактериальных клеток, приводящей к формированию плодовых тел (некоторые группы клеток внутри созревающего плодового тела также обречены на гибель) (54).

Прокариотическим аналогом апоптоза можно также считать гибель части клеточной популяции E. coli в условиях стазиса – остановки роста бактериальной популяции (например, при исчерпании питательного субстрата). "Феноменология" данного процесса описана сравнительно давно (55) (см. также наш обзор (4)). Голодающая популяция E. coli постепенно разделяется на две субпопуляции, одна из которых гибнет и подвергается автолизу, в то время как другая субпопуляция использует продукты автолиза как субстрат и продолжает расти и создавать колониеобразующие единицы (55). В последние годы был раскрыт генетический механизм апоптоза в этой системе (56, 57). Геном E. coli содержит оперон с двумя генами mazE и mazF. Ген mazF кодирует стабильный цитотоксический белок, а mazE – нестабильное, быстро разрушаемое протеазой clp PA противоядие к белку MazF. Как известно, исчерпание доступного клетки фонда аминокислот ведёт к активации оперона rel, чей белковый продукт Rel A отвечает за синтез гуанозинтетрафосфата на рибосомах. Гуанозинтетрафосфат блокирует оперон maz, так что синтез противоядия прекращается. В этих условиях белок MazF вызывает гибель и автолиз части популяции, тем самым пополняя фонд аминокислот и вновь активируя синтез противоядия MazE у оставшихся в живых клеток (56, 57). Таким образом, система выступает как хромосомный аналог многочисленных бактериальных плазмид, которые кодируют стабильный цитотоксичный агент в комбинации с лабильным противоядием к нему (addiction modules).

Этот пример апоптоза у E. coli одновременно может быть рассмотрен и как пример "бактериального альтруизма", так как в экстремальных условиях часть голодающих клеток лизируется, способствуя выживанию остальной части клеточной популяции (56, 58). Авторы настоящего обзора не отрицают наличие других, более мощных механизмов сохранения жизнеспособности голодающей микробной популяции – процессов "экономизации" энергодающих метаболических процессов, исследованных в работах Н.С. Паникова (59-61).

Современная социобиология – модификация дарвиновской теории эволюции, обращающая основное внимание на социальные взаимодействия у различных форм живого – рассматривает так называемую концепцию родственного альтруизма (62). Речь идёт о самопожертвовании ради близкого родственника, имеющего общие гены с индивидом, приносящим себя в жертву. По сути, это на "альтруизм" в общечеловеческом смысле слова, а клонирование собственных генов, которые получают альтернативный способ передачи следующему поколению (не через данного индивида, а через его родственника). Слово "родственный альтруизм" (kin altruism) – устоявшийся термин в среде социобиологов, но он не предполагает осознанную жертву, а лишь подхватывание естественным отбором генов "гибели ради родственника" (62).

В рамках этой концепции, микроорганизмы с преобладанием бесполого размножения имеют намного больше оснований совершать апоптоз (если он способствует выживанию популяции), чем многоклеточные существа. Действительно, колония как про-, так и многих эукариотических организмов (например, рассмотренного выше D. discoideum) представляет собой почти идеальный клон. Поэтому социобиологическая концепция родственного альтруизма, если она верна, предсказывает широкое распространение "альтруистических" событий в колониях микроорганизмов (9, 58).

В этой связи представляет интерес тот факт, что описанные примеры апоптоза не являются единственными "альтруистическими" системами в мире микроорганизмов. Подобно эукариотическим инфицированным клеткам, гибнущим, чтобы не допустить распространения инфекции, некоторые штаммы E. coli несут гены, вызывающие гибель клетки после внедрения в неё бактериофага Т4 (63). Так, ген lit блокирует синтез всех клеточных белков в ответ на начало экспрессии поздних генов фага Т4, поскольку кодирует протеазу, разрушающую необходимый для синтеза белков фактор элонгации EF-Tu (64). Ген prrC кодирует нуклеазу, расщепляющую лизиновую тРНК. Нуклеаза активируется продуктом гена stp фага Т4 (63). Гены rex вызывают у инфицированных фагом Т4 клеток формирование ионных каналов, ведущих к потере клетками жизненно важных ионов и к альтруистической гибели, если только фаг не закрывает каналы своими белками, продуктами генов rII (65).

Любопытно, что гены, отвечающие за гибель клетки в ответ на фаговую инфекцию не склонны стабильно встраиваться в хромосому (а гены rex вообще относятся к геному фага (и экспрессируются в лизогенных клетках) (63). Можно предположить, что "альтруистические" гены, будучи подвижными и легко утрачиваемыми генетическими элементами, функционируют только у части бактериальной популяции, Если это предположение справедливо, то бактериальная колония представляет собой смесь "альтруистов" и "эгоистов". Такой смешанный состав характерен для групп высших животных (например, крыс) и даже людей, по сообщению Б.М. Медникова (66).

Кворум и химическая коммуникация у микроорганизмов

В последнее десятилетие неуклонно расширяется список изученных микробных процессов, реализуемых только при наличии достаточной плотности популяции (кворума). Эти исследования продолжают начатые уже около 100 лет тому назад изыскания. Уже тогда исследовался, например, вопрос о том, почему культивирование бактерий часто не удается, если взята слишком низкая плотность инокулята. В 1988 г. Дж. Шапиро (34) также писал, что споры миксобактерий прорастают только при достаточно высокой их концентрации в среде. Уже в начале 80-х годов, как известно, изучением плотность-зависимых процессов в микробных популяциях активно занимались В.И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан и др. (см., например (67, 68)). Была исследована природа некоторых химических факторов (ауторегуляторов), накапливающихся в культуре и вызывающих те или иные эффекты, например, автолиз клеток (фактор d₂ жирнокислотной природы (68)). Оригинальные отечественные и зарубежные работы 80-х годов обобщены в монографии А.С. Хохлова "Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы" (69).

Работы 90-х годов резко усилили интерес к "эффектам кворума" в популяциях микроорганизмов. К числу описанных к настоящему времени процессов, протекающих лишь при достаточно высокой плотности популяции, принадлежат следующие явления (1, 8-15, 70):

• Биолюминисценция у морских бактерий (Vibrio fischeri, V. harveyi).
• Агрегация клеток миксобактерий и последующее формирование плодовых тел со спорами
• Конъюгация с переносом плазмид у Enterococcus faecalis и родственных видов, а также у клубеньковых бактерий рода Agrobacterium
• Формирование клеток-швермеров у бактерий родов Proteus и Serratia
• Синтез экзоферментов и других факторов вирулентности у растительных (Erwinia carotovora, E. hyacinthii и др.) и животных (Pseudomonas aeruginosa) патогенов.
• Образование антибиотиков у представителей рода Streptomyces и у Erwinia carotovora
• Споруляция у бацилл и актиномицетов
• Стимуляция роста стрептококков и ряда других микроорганизмов

Раскрыты механизмы многих из указанных процессов; определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за плотностно-зависимые процессы. Здесь необходимо сказать несколько слов о биокоммуникации в целом (предмет особой биологической науки под названием биосемиотика). Среди изучаемых данной наукой каналов коммуникации между живыми организмами, три канала коммуникации являются наиболее эволюционно-консервативными и в полной мере функционируют уже у одноклеточных форм жизни (4, 5). Речь идёт о передаче информации путём 1) непосредственного (физического) контакта между организмами; 2) выработки диффундирующих в среде химических агентов; 3) генерации тех или иных физических полей. Все три канала коммуникации, вероятно, принимают участие в "эффектах кворума".

Физический контакт между организмами. Некоторые из плотностно-зависимых процессов включают в себя стадии, контролируемые недиффундирующими химическими факторами. Они прикреплены к генерировавшей их клетке, и их восприятие рецепторами другой клетки требует непосредственного межклеточного контакта. Так, в голодающей популяции миксобактерий Myxococcus xanthus наблюдается агрегация клеток с последующим формированием плодовых тел со спорами (эукариотическим аналогом этой системы служит кратко рассмотренный выше Dictyostellium discoideum). Процесс находится под контролем как диффундирующих, так и недиффундирующих химических факторов. Поздние его стадии, когда клеточная агрегация уже идёт в течение 6 часов и необходимо обеспечить достаточно компактную укладку клеток для формирования спор, контролируются недиффундирующим, прикреплённым к поверхности клетки белковым фактором С (продукт гена csgA) (10, 71, 72). Мутанты по гену csgA не способны к согласованным клеточным движениям, необходимым для компактного расположения палочковидных клеток M. хanthus; эти мутанты не формируют и плодовых тел. Идентифицировано по крайней мере 16 генов, чья экспрессия зависит от фактора С (72).

Физический контакт клеток необходим также при коммуникации посредством поверхностных органелл, таких как например пили, и компонентов экзоплимерного матрикса, покрывающего отдельные клетки, их группы, всю колонию в целом. В частности, процесс агрегации и споруляции у M. xanthus зависит от пилей типа IV (гомологи пилей типа IV есть у патогенных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Neisseria gonorhoeae, где они также обусловливают социально координированные клеточные движения (73)), от полисахаридно-белковых фибрил и от липополисахаридного О-антигена внешнего слоя наружной мембраны (1, 73, 74). Все эти поверхностные клеточные структуры синтезируются с помощью так называемых S (social) генов, ответственных за коллективные, координированные перемещения клеток и формирование структур надклеточного уровня. Им противопоставляют также имеющиеся у миксобактерий А (adventurous) гены, позволяющие индивидуальным клеткам покидать край растущей колонии.

Своего рода промежуточное положение между недиффундирующими и свободно диффундирующими агентами коммуникации у миксобактерий занимают тяжи (trails) из биополимеров матрикса, которые отделяются от образовавшей их клетки, тем самым пролагая путь другим клеткам-"путешественницам", дающим начало дочерним колониям (75). Интересно, что аналогичную роль в сообществе муравьев играют так называемые следовые торибоны, маркирующие след мураьвьёв-фуражиров ("первопроходцев") (76). Естественно, что роль контактной (и "следовой") коммуникации в её различных вариантах не ограничивается только миксобактериальными системами. Например, пили участвуют в агрегации клеток в колониях Neisseria gonorrhoeae (1). У эукариотических микроорганизмов, в частности, у Dictyostellium discoideum, контактные взаимодействия участвуют в морфогенезе наряду с диффундирующими химическими агентами. Несоменную роль в этих взаимодействиях играют гликопротеины, характеризующие дальнейшую судьбу клеточных субпопуляций: клетки, дающие в дальнейшем споры, несут гликопротеин PsA, в то время как совершающая апоптоз субпопуляция (будущая ножка плодового тела) имеeт антиген MUD9 (77).

Дистантная химическая коммуникация на службе "эффектов кворума". Тема химической коммуникации у микроорганизмов настолько широка (она была рассмотрена в более ранних авторских работах (4, 5, 78)), что мы ограничимся только теми диффузными химическими агентами, чьё участие в "эффектах кворума" установлено. Речь будет идти о следующих классах соединений: 1) ацилированные лактоны гомосерина, регулирующие широкий круг плотностно-зависимых коллективных процессов у грамотрицательных бактерий; 2) пептиды, регулирующие конъюгативный плазмидный перенос у Enterococcus, развитие воздушного мицелия у Streptomyces, споруляцию у бацилл и др.; 3) аминокислоты и сходные с ними аминные соединения, регулирующие агрегацию бактериальных клеток (E. coli, Salmonella typhimurium, Myxococcus xanthus) и формирование швермеров у Proteus mirabilis.

1. Кворум-зависимые системы с лактонами гомосерина