Скачать

И.В.Мичурин

Актуальность проблемы: В патогенезе вирусных инфекций чрезвычайно важную роль играет гибель клеток, реализующаяся в форме некроза или апоптоза. Некроз является результатом травматического повреждения клетки, приводящего к нарушению целостности клеточных мембран. Апоптоз, запрограммированная или “физиологическая” форма клеточной гибели, реализуется посредством заложенных в генотипе клетки механизмов самоуничтожения и морфологически характеризуется уменьшением размеров клетки, уплотнением и фрагментацией хроматина (Погорелов В.М., Козинец Г.И., 1995; Ярилин А.А., 1996; Маянский А.Н. и соавт., 1997; Утешев Д.Б. и соавт., 1998).

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) – лимфопролиферативное заболевание, возбудителем которого является вирус Эпштейна-Барр (EBV), относящийся к семейству герпесвирусов (Дранкин Д.И., Заяц Н.А., 1982). Уникальность EBV заключается в его способности не разрушать, а стимулировать пролиферацию зараженных им лимфоцитов путем изменения соотношения между ростовыми и апоптозными потенциями клеток (Дранкин Д.И., Заяц Н.А.,1982).

Известно более десятка вирусных генов, которые кодируют факторы, усиливающие апоптозный процесс. Имеются они и у герпесвирусов. Некоторые вирусы способны блокировать апоптозный ответ на собственную инфекцию. Это достигается с помощью двух механизмов – повышения экспресии антиапоптозных (рост-стимулирующих) генов клетки и инактивации эффекторных молекул апоптоза. К первому механизму можно отнести стимуляцию протоонкогена типа Вcl-2, которая наблюдается, в частности, при персистенции EBV в В-лимфоцитах (Uehara T. e.a., 1992; Akbar A.N. e.a., 1993).

Однако необходимо отметить, что несмотря на проведение достаточно большого количества исследований, посвященных изучению процессов клеточной гибели, сведения, касающиеся особенностей апоптоза клеток крови при действии EBV, в доступной литературе крайне немногочисленны и фрагментарны, что и послужило причиной настоящего исследования.

Цель исследования: Установить особенности апоптотической активности лимфоцитов периферической крови при инфекционным мононуклеозом и острыми инфекционными заболеваниями с мононуклеозоподобным синдромом.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать количественные показатели периферической крови у больных инфекционным мононуклеозом и острыми инфекционными заболеваниями с мононуклеозоподобным синдромом в различные фазы течения и в отдаленном периоде после болезни;

2. Провести оценку жизнеспособности лимфоцитов периферической крови у больных инфекционным мононуклеозом и острыми инфекционными заболеваниями с мононуклеозоподобным синдромом в различные фазы течения и в отдаленном периоде после болезни;

3. Оценить содержание фрагментированной ДНК в лимфоцитах периферической крови у больных инфекционным мононуклеозом и острыми инфекционными заболеваниями с мононуклеозоподобным синдромом в различные фазы течения и в отдаленном периоде после болезни;

4. Оценить содержание лимфоцитов периферической крови с морфологическими признаками апоптоза у больных инфекционным мононуклеозом и острыми инфекционными заболеваниями с мононуклеозоподобным синдромом в различные фазы течения и в отдаленном периоде после болезни;

5. Установить особенности и оценить степень изменений апоптотической активности лимфоцитов при инфекционном мононуклеозе и мононуклеозоподобном синдроме в зависимости от сроков исследования.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Инфекционный мононуклеоз.

Инфекционный мононуклеоз (ИМ) представляет собой острое, обычно доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, чаще всего встречающееся в детском юношеском возрасте (реже у взрослых), сопровождающееся иногда серьезными осложнениями, а в редких случаях даже приводящее к летальному исходу (Живица Л.В. и соавт.,1987; Дунаевский О.А., Постовит В.А.,1982). Заболевание вызывается EBV, что впервые было показано Henle и соавторами (Купчинский Р.А.,1994).

Вирус EBV представляет собой В-лимфотропный вирус человека, относится к семейству Herpesviridae, подсемейства Gammaherpesviridae, рода Lymphocryptovirus (Львов Н.Д., Мельниченко А.В.,1999). Для него характерна сферическая форма и наличие 4 структурных компонентов: сердцевина, капсида, внутренние оболочки, внешние оболочки. Сердцевина содержит линейную двунитчатую вирусную ДНК, которая состоит из 80 генов. Размер вириона у основного возбудителя ИМ колеблется от 100 до 150 нм (Бисярина В.П. и соавт.,1980; Shuster W. e.a.,1993). В составе вирионов обнаружено более 30 гликопротеидов, которые находятся на поверхности и вызывают образование вируснейтрализующих антител (Albeck H. e.a.,1985). Вирус чувствителен к воздействию эфира, весьма специфичен в отношении роста: размножается в культурах лимфобластов опухоли Беркитта, крови больных ИМ, лейкемических клетках и в культуре клеток мозга здорового человека. (Дранкин Д.И., 1982;). Устойчивость EBV во внешней среде низкая. Он быстро погибает при высыхании, высокой температуре, обработке всеми дезинфицирующими средствами (Imai S.,1990).

EBV отличается от других вирусов семейства герпеса способностью вызывать не цитолиз, а размножение пораженных клеток – В-лимфоцитов. Вирус способен к длительной персистенции в них (Khanna R. e.a.,1995).

Проникновение EBV в клетку хозяина является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя прикрепление вирионов к клеточным рецепторам, эндоцитоз и слияние мембран вирионов и клетки. В результате этого капсид освобождается от белков внешней оболочки, а комплекс ДНК-белок вируса проникает в ядро (Wutzler P.,1993). Вирионная ДНК выходит в нуклеоплазму и транскрибируется клеточной РНК-полимеразой, затем проходит процессинг мРНК, синтез кодируемых продуктов и частичный обратный транспорт их в ядро, репликация ДНК и формирование дочерних молекул (Wilson A.D. e.a.,1998). Образовавшиеся в ядрах клеток незрелые капсиды попадают в цитоплазму, где заканчивается формирование зрелых капсидов и внешней оболочки вируса с последующим транспортом к поверхности и выходом их из клетки (Nikolas J.C. e.a.,1998; Straus S.E. e.a.,1993).

При проникновении в организм человека первоначально EBV поражает эпителиальные клетки носо- и ротоглотки, а затем инфицирует В-лимфоциты, участвующие в диссеминации возбудителя по организму (Дранкин Д.И., Заяц Н.А., 1982).

Эпителиальные клетки могут быть инфицированы EBV через EBV-специфичный С2- рецептор. При этом процессы деления, дифференцировки и созревания клеток эпителиального слоя протекают параллельно с процессом активного вирусного воспроизводства (Taga H. e.a.,1995; Wakasugi N. e.a.,1990). Таким образом, как считают авторы, "эпителиальная EBV-инфекция" - играет решающую роль в воспроизводстве и пожизненной персистенции вируса в организме человека (Foss H.D.1995; Ritter S., Schroder S.,1996).

По современным данным, EBV является возбудителем ИМ в 90% случаев заболевания. К гипердиагностике ИМ у детей могут привести острые инфекционные заболевания с мононуклеозоподобным синдромом (ОИЗ с МПС). Так МПС может наблюдаться при цитомегалии, иерсинеозе, токсоплазмозе и различных формах ангин (фоликулярная, лакунарная, некротическая).

Считается, что во всех случаях EBV играет свою роль совместно с другими факторами, вызывающими иммуносупрессию. В этой связи, заслуживают внимание работы, касающиеся связи EBV и ВИЧ. EBV выявляется в ротовой полости у ВИЧ-инфицированных больных (Жданов В.М.,1984; Anderson J. e.a.,1986). Механизм взаимодействия EBV с ВИЧ не установлен, хотя известно, что оба вируса поражают одни и те же рецепторы лимфоидных клеток. Высказывается предположение о том, что EBV может блокировать проникновение ВИЧ в клетку (Зуев В.А.,1988). С другой стороны, имеются сообщения о том, что продукты деятельности EBV активируют экспрессию вируса СПИД (Йегер Л.,1990).

Определяющими проявлениями заболевания являются: клиническая картина (высокая температура, ангина, увеличение лимфоузлов, печени, селезенки), характерные гематологические изменения (увеличение общего количества мононуклеарных клеток и атипичных лимфоцитов) и положительная реакция на гетерофильные антитела (Bevinck J.N.B. e.a.,1993; Cozad J.,1996; Moss D.J. e.a.,1992). Следует, однако, отметить, что ни один из указанных признаков не является специфичным для ИМ (Титов и соавт.,1999; Kube D. e.a.,1995). Диагноз заболевания ставится по совокупности клиники и лабораторных данных. (Гаспарян М. О. 1972; Жибурт и соавт.,1996; Titov L.P. e.a.,1995,1996).

Инкубационный период длится от 2 до 30 дней, чаще 4-7 дней. Заболевание обычно начинается остро, с озноба и повышения температуры до 38-39 С. У некоторых больных в течение 2-3 дней отмечаются продромальные явления в виде слабости, недомогания, потери аппетита (Di Giuseppe J.A. e.a.,1995; Matter L. e.a.,1987). Заболевание может давать рецидивы. Больные обычно бледны, конъюнктивы умеренно гиперемированы (Мусабаева И.К.,1982; Леенман Е.Е. и соавт.,1999; Verdium C.M. e.a.,1995). На 2-3 день болезни иногда возникает скарлатиноподобная, узелковая или папулезная сыпь, а у детей при тяжелом течении заболевания геморрагическая сыпь. Исчезновение сыпи может сопровождаться отрубевидным шелушением (Уразова Л.Н. и соавт.,1989; Schuster V. e.a.,1992). Постоянным симптомом первых дней болезни является увеличение передне- и заднешейных лимфоузлов, одновременно увеличиваются и другие группы лимфоузлов: подмышечные, паховые. Лимфоузлы плотноватые, болезненные, никогда не спаиваются с окружающей клетчаткой и кожей, не наблюдается их нагноения (Серебряная и соавт.,1998; Hinderer W. e.a.,1990). Может наблюдаться изолированное увеличение внутригрудных лимфоузлов, что вызывает серьезные дифференциально-диагностические затруднения. Реакция лимфоузлов брюшной полости может проявляться болями в животе, особенно в правой подвздошной области (симптом Корсакова) (Wising P.J.,1939,1942). Процесс обратного развития в лимфоузлах начинается с нормализации температуры, но обычных размеров они достигают в течение 1-2 недель периода реконвалесценции, а иногда и через несколько месяцев (Чирешкина Н.М.,1973; Naher H. Petzoldt D.,1992).

Заболевание обычно сопровождается ангиной, которая по своему характеру бывает лакунарной, катаральной, фолликулярной и язвенно-дифтеритической. В первые дни болезни ангина, как правило, односторонняя и носит характер катаральной, а с 3-4 дня отмечается ангина, которая рассматривается как результат аллергизации организма (Murtagh J.,1990; Toren A.,1996; Wolf Y. e.a.,1993). Если в этот период присоединяется вторичная инфекция, у больного повышается температура и ухудшится самочувствие. Изменения в зеве исчезают через 1-2 недели после начала заболевания (Grasi G. e.a.,1993). Иногда ангина отсутствует, часто она сопровождается резкой гиперемией слизистой оболочки зева и носоглотки (“пылающий зев”) (Mayer I. e.a.,1992; Wurtzler P.,1993).

К важным симптомам относятся увеличение печени и селезенки. Печень плотная, в ряде случаев нарушается ее функция, появляется желтуха. Селезенка плотная, чувствительна при пальпации, иногда достигает больших размеров, приводящих к ее разрыву (Kanegane H. e.a.,1995,1997). Поражение других органов и систем наблюдается редко. Имеются единичные указания на развитие пневмоний в начале заболевания, но диагностировать их можно только рентгенологически. У больных отмечается приглушение тонов сердца, в ряде случаев на ЭКГ регистрируется диффузное поражение миокарда (Блюмкин В.Н., Жданов В.М.,1973).

Язык обычно обложен белым налетом, влажный, иногда бывает тошнота, рвота. Большинство больных жалуются на вялость, головную боль, бессонницу (Мордовец В. И, Рудакова Р. И., Гуськова Т. Б.1986; Gosselin J. e.a.,1991).

У больных ОИЗ с МПС наблюдается подобная картина заболевания: лихорадка, аденопатия, нарушение носового дыхания, ангина, увеличение размеров печени и селезенки. Ангина с наложениями на миндалинах, как правило, сопровождалась реакцией регионарных лимфоузлов, степень увеличения которых соответствовала поражению зева.

1.2. Картина крови при ИМ

Картина крови при ИМ является самым достоверным диагностическим критерием (Anagnostopoulos I. e.a.,1995). Общепринятым является мнение о том, что для ИМ характерна триада симптомов со стороны белой крови: умеренный лейкоцитоз, резкий мононуклеоз и качественное изменение мононуклеаров - появление атипичных клеток (АМ) (Gratama J.W. e.a.,1994).

Анемия не характерна для болезни Филатова, но в разгар заболевания гемоглобин обычно падает на 10-15 единиц (Гаспарян М.О., Шиленкова В.И.,1972; De Paoli P. e.a.,1990). Общее количество лейкоцитов либо оставалось нормальным на протяжении всего заболевания, либо умеренно повышалось. Чаще всего лейкоцитоз отмечался на 1 день болезни. Иногда у детей раннего возраста незначительно повышалось количество эозинофилов. Эозинофилия наиболее отчетливо выявляется на 2, 3 и 4 неделе болезни (Joseph G. e.a.,1994).

Отмечается небольшое увеличение количества палочкоядерных нейтрофилов. Палочкоядерный сдвиг наблюдается у детей всех возрастных групп, однако если у детей раннего возраста он отмечался в 60% случаев, то у детей более старшего возраста (после трех лет) в 83% (Балашева Т.Б. и соавт.,1996). Количество сегментоядерных нейтрофилов у большинства больных оставалось в пределах нормы, реже количество этих клеток снижалось. Нейтропения наблюдалась главным образом у детей старшего возраста. У детей раннего возраста в период реконвалесценции (4-5 неделя болезни) нередко выявлялся нейтрофилез (Imreh M.P. e.a.,1995). Количество нормальных лимфоцитов при ИМ у большинства детей уменьшалось. Наиболее часто уменьшение количества лимфоцитов отмечалось на 1 и 2 неделе болезни. Увеличение количества нормальных лимфоидных клеток наблюдалось значительно реже, чем лимфопении и нормальное их содержание (Гаспарян М.О., Шиленкова В.И.,1972). Количество моноцитов у большинства детей, на протяжении всего заболевания, оставалось в пределах нормы. В 20-40% случаев наблюдается уменьшение количества моноцитов. Моноцитоз отмечался только в 15-30% случаев, наиболее отчетливо был выражен на 1 неделе болезни и чаще наблюдался у детей старшего возраста. Моноцитоз является одним из симптомов раздражения ретикуло-эндотелиальной системы (Котельников В.М. и соавт.,1982). АМ обнаруживаются у всех обследованных. Чаще всего они выявляются на 1 неделе заболевания- 76-85% случаев, на 2 неделе- в 62-79%, на 3- в55-74% и на 4- в 20-50% случаев (Жибурт Е.Б. и соавт.,1996). Более длительно АМ сохранялись в периферической крови у детей в возрасте от 1 до 3 лет (Beaulieur A.D. e.a.,1996).

Для детей с ОИЗ с МПС выявлена схожая гематологическая картина заболевани. Повышение АМ носило более сглаженный характер. В результате сравнительного изучения белой крови при ОИЗ с МПС и ИМ у детей в момент максимальной выраженности симптомов выявили ряд отличий (Мазурина Н.А. и соавт., 1996). Так, при ОИЗ с МПС общее количество лейкоцитов было меньше, чем при ИМ, число сегментоядерных нейтрофилов почти в 2 раза больше, а содержание АМ в 2 раза меньше, чем при ИМ. При ОИЗ с МПС чаще всего наблюдается увеличение общего количества нейтрофилов и снижение содержания мононуклеаров. В то же время при ИМ всегда отмечается общий мононуклеоз и уменьшение общего количества нейтрофилов (Баринский И.Ф. и соавт., 1994). Таким образом, несмотря на наличие АМ, при ОИЗ с МПС гематологические сдвиги отличаются от таковых при ИМ и могут быть использованы при дифференциации этих заболеваний (Выдумкина С.П. и соавт., 1999).

Электронно-микроскопическое исследование показало, что в периферической крови больных ИМ преобладают элементы лимфоцитарного и моноцитарного рядов. Специальное изучение морфологии АМ с помощью светового микроскопа показало, что ядро их чаще всего имеет неправильную форму, расположено эксцентрично. Структура ядра в одних клетках грубая, с просветлениями между глыбками хроматина, а в других ядерное вещество распределено равномерно, нередко с 1-2 нуклеолами (Lewin N. e.a.,1990). Цитоплазма, как правило, обильная, в части клеток с неровными контурами, разнообразная по степени базофильности- от едва выраженной (“обесцвеченная цитоплазма”) до интенсивной, с перинуклеарной зоной или без нее. Иногда встречались клетки с выраженной “пенистостью” цитоплазмы (Nakata M. e.a.,1992). Исследование поверхностной архитектоники моноцитов у больных ИМ проводилось в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания (4-15 сутки) (Anagnostopoulos I. e.a.,1995). Исследование рельефа поверхности моноцитов у детей с ИМ выявило снижение содержания клеток с пузыреподобными структурами и переходным типом клеточной поверхности. Обращает на себя внимание значительное уменьшение в крови больных числа моноцитов с ворсинками и относительно гладкой поверхностью (Ютенко А.К. и соавт.,1994; Ribera E. Ocana I.,1989). Количество же моноцитов с совершенно гладкой поверхностью мембраны, напротив, превышало нормальные значения. Кроме того, в крови детей с ИМ в большом количестве обнаруживаются моноциты с гребнеподобными структурами (Уразова О. И., Новицкий В. В., Помогаева А. П., Жукова О. Б., 2000). Отличительной особенностью клеточного состава периферической крови у больных ИМ явилось присутствие клеток с неглубокими точечными впадинами на поверхностной мембране, которые не обнаруживались в крови здоровых детей (Турковская Н. Н.,1977). Следует отметить также, что распределение моноцитов по типу их поверхностной мембраны у детей с легкой и средней степенью тяжести заболевания носило аналогичный характер. Таким образом, заболевание ИМ сопровождается выраженными перестройками структурной организации мембран моноцитов и появлением в крови инфицированных детей атипичных клеток, не встречающихся в норме (Новицкий В. В.,Уразова О. И., Антоненко Н. М., Жукова О. Б., 1999).

Методом сканирующей электронной микроскопии исследовали поверхностную архитектонику лимфоцитов у больных ИМ. Исследование проводилось в период развернутой клиникогенной картины заболевания (4-15 день) (Masucci M.C. e.a.,1987). В крови детей, больных ИМ, среди лимфоцитов со сглаженной формой поверхностной мембраны преобладала популяция клеток с относительно гладкой поверхностью, а среди клеток с выраженным рельефом поверхности доминировали лимфоциты с ворсинками, что соответствовало показателям здоровых детей. Незначительно увеличивалось число гладких клеток и лимфоцитов с раффлами на поверхности мембраны (Beaulieur A.D. e.a.,1996). Однако, содержание лимфоидных клеток со складчатой поверхностью существенно превышало их количество в контроле. Число же лимфоцитов с углублениями на поверхности мембраны у больных детей снижалось. Значительно реже обнаруживались клетки с пузыреподобными образованиями, переходным и комбинированным типом поверхностной мембраны (Жибурт Е.Б. и соавт.,1996; Joseph G. e.a.,1994). У детей со средней степенью тяжести заболевания содержание клеток со складками значительно превышало значения аналогичного показателя у детей с легким течением инфекции. Особый интерес представляет факт увеличения в крови больных ИМ, особенно у детей со средней степенью тяжести заболевания, числа лимфоцитов со складчатой поверхностью (Lewin N. e.a.,1990). По-видимому, наряду с нормальными лимфоцитами в эту группу клеток были отнесены “атипичные мононуклеары”, имеющие аналогичную структуру поверхностной мембраны.

Особый интерес представляет выявление в крови клеток, отличающихся по своей морфологической структуре присутствием на поверхности ворсинок, неправильной формой ядра с компактно расположенным хроматином, гипертрофией ядрышек, многочисленными рибосомами, повышенным количеством лизосом и митохондрий, вакуолизированной цитоплазмой. В ядрах ряда таких измененных клеток были обнаружены вакуоли правильной округлой формы, что позволяет предположить наличие вируса в данных клетках (Ютенко А.К. и соавт.,1994; Ribera E. Ocana I.,1989). По всей видимости, данные клеточные элементы представляют собой так называемые “атипичные мононуклеары”, являющиеся трансформированными вирусом лимфоцитами, имеющими аналогичную структуру клетки (Gibbons D.L. e.a.,1994). В крови больных ИМ превалировали макрофагоподобные моноциты, отличавшиеся от аналогичных клеток здоровых детей повышенным количеством вторичных лизосом, содержащих деструктивный материал, увеличением числа и величины митохондрий, повышенным содержанием и увеличением диаметра вакуолей комплекса Гольджи (Уразова О. И., Новицкий В. В., Помогаева А. П., Жукова О. Б., 2000).

Учитывая тот факт, что ИМ представляет собой реактивное заболевание, охватывающее всю ретикулогистиоцитарную систему, тщательному анализу была подвергнута система иммуноглобулинов (Gogusev J. e.a.,1988). Показано, что гетерофильные антитела относятся к Ig M. синтез которых значительно повышен у больных ИМ; синтез IgG повышен незначительно, а IgA не изменены (Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995).

1.3.Апоптоз

1.3.1.Апоптоз как форма гибели клеток

Апоптоз впервые был описан J.F.R.Kerr и сотрудниками в 1972 году (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996). В 1987 A.H.Wyllie сформулировал четыре основных элемента апоптоза:

1. Уменьшение объема апоптотирующей клетки;

2. Конденсация и фрагментация хроматина на ранних стадиях апоптоза с формированием апоптотических телец;

3. Изменение мембраны апоптотирующей клетки, приводящее к распознаванию ее фагоцитами;

4. Сопряженность апоптоза с активным белковым синтезом (Уманский С.Р., 1996; Ярилин А.А., 1996)

В расширенном смысле апоптоз является гибелью клетки, которая включает в себя генетическую или геноопосредованную программу, не зависящую от природы пускового сигнала. Другими словами апоптозу присуща экспрессия генов de novo, а пусковые сигналы сами по себе не являются гибельными для клетки.

Апоптоз - активный процесс реализации программы гибели клетки: он может быть вызван действием поступающих извне сигналов, которые сами по себе не являются токсическими или деструктивными. Этот тип гибели иногда обозначают как самоубийство клетки. Апоптоз является обязательным компонентом жизни многоклеточных организмов (их развития, нормального функционирования, осуществления регуляторных процессов), одновременно внося вклад в реакцию клеток на внешние воздействия (например, ионизирующие излучения) и проявления иммунной защиты (Jiang C. e.a.,1993). В соответствии с современными представлениями апоптоз - явление неоднородное. В зависимости от индукторных факторов различают несколько его вариантов, которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям. Как правило, все эти разновидности имеют идентичные заключительные этапы развития и одинаковые морфологические проявления. В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоптоза: гибель клеток вследствие дефицита ростовых факторов, апоптоз, вызванный глюкокортикоидами и другими агентами со сходным действием и “активационный апоптоз”, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов или по другим причинам, обуславливающим включение программы гибели клетки при их активации (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961).

1.3.2. Морфологические и биохимические проявления апоптоза

Прежде всего это морфологические признаки апоптоза, состоящие в уменьшении размеров, сморщивании клетки, уплотнении и фрагментации хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Эти изменения служат самым ранним проявлением апоптоза, предшествующим процессам деградации (Демин А.А. и соавт.,1983). На этой стадии прогрессирования апоптоза может быть приостановлено действие ингибиторов, всвязи с чем данная стадия развития клеточной гибели обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называют апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходит конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерна потеря клеточной мембраной микроворсинок и нормальной складчатости, отделение клетки от субстрата, формирование на ее поверхности пузырей (Барышников А.Ю. и соавт.,1994).

В отличие от некроза, когда одновременно гибнут массы соседствующих клеток, апоптоз развивается изолированно в единичных клетках. Если в случае некроза из клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что нередко приводит к развитию или прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные проявления отсутствуют (Мушецяну К и соавт.,1965). Клетки, подвергшиеся апоптозу (а иногда и находящиеся в процессе апоптоза), и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и “непрофессиональными” фагоцитами (например, мезангиальными клетками почек) (Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995).

Одно из основных проявлений апоптоза на биохимическом уровне реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК, содержащих 700, 200-250, 50-70 тысяч пар оснований (т.п.о.), позже 30-50 т.п.о. Уже на этой стадии регистрируется конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно эти начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после осуществления которого процесс становится необратимым (Погорелов В.М., Козинец Г.И.,1995).

Следующий этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т.е. расщепление в результате формирования разрывов (в основном двунитевых) между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 п.о. Именно эти фрагменты выявляются в виде “лесенки” при электрофорезе ДНК апоптотических клеток, который широко используется для идентификации апоптоза (Казанова Л.И.,1979; Marmur J.,1961).

Деградация хроматина при апоптозе является активным процессом, она зависит от температуры, требует синтеза РНК и белка de novo. Осуществление различных этапов деградации ДНК связывают с проявлением активности разных ферментов. Считают, что межнуклеосомная деградация при апоптозе обусловлена активацией резидентной ядерной Са^2Мg^2зависимой эндонуклеазы (Исаева М.П. и соавт.,1998). Выделена эндонуклеаза с молекулярной массой 18 кД. Мало сведений о ферментах, обеспечивающих появление крупных разрывов ДНК. По одним сведениям, они не зависят от Са²⁺ (хотя и зависят от Мg²⁺), по другим данным, формирование крупных фрагментов ДНК так же зависит от Са²⁺. Феномен апоптоза неоднороден и при действии различных его индукторов, события, по крайней мере до определенного этапа, могут развиваться по разнообразным сценариям, и лишь достигнув определенной точки конвергенции, различные пути сходятся, а механизмы реализации гибели оказываются идентичными. К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию цистеиновых и сериновых протеиназ. Ингибиторы сериновых протеиназ подавляют апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами (Bnuin de P.S. e.a.,1995; Garrido F. e.a.,1995).

Наблюдаемые при апоптозе уплотнение и деформация наружной и внутриклеточной мембран, формирование устойчивого к действию детергенов покрова, сморщивание цитоплазматических гранул связывают с перекрестным сшиванием белков, обусловленным активацией Са²-зависимой трансглутаминазы типа II, что служит обязательным и характерным биохимическим признаком апоптоза. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе, вероятно, служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации поли (ADP- рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961).

1.3.3. Распознавание апоптотирующей клетки макрофагами

К настоящему времени расшифровано три механизма, с помощью которых макрофаги распознают клетки, подвергающиеся апоптозу, и удаляют их.

Распознавание, а следовательно и адгезия макрофагов к клеткам, вступившим на путь апоптоза, почти полностью блокируется при добавлении в среду N-ацетилгалактозамина и галактозы. Из этого следует, что ранним мембранным проявлением апоптоза является специфическая перестройка углеводных компонентов мембраны с потерей сиаловых кислот, наружной экспрессией сахаров и снижением общего отрицательного потенциала наружной поверхности мембраны. Потеря терминальных сиаловых кислот с боковых цепей мембранных гликопротеидов влечет за собой то, что экранированные в обычных условиях ацетилглюкозамин, N-ацетилгалактозамин и галактоза приобретают возможность взаимодействовать с лектинами макрофагов (Taga H. e. a. , 1994)

Другой тип распознавания апоптотирующих клеток осуществляется с помощью макрофагального 43 интегринового рецептора. Тромбоспондин, синтезируемый и выбрасываемый в микроокружение макрофагами, выполняет роль молекулярной скрепки между апоптотирующей клеткой и макрофагом. Существенную роль в этом процессе играет мембранный мономер 88кД, больше известный как CD36. Третий механизм распознавания клеток, вступивших на путь апоптоза, состоит в том, что на самых ранних этапах программированной гибели клеток, еще до формирования апоптотических телец, происходит инверсия мембранных фосфолипидов. В обычных условиях наружный лепесток мембранного бислоя содержит, в основном, нейтральные фосфолипиды, сфингомиелин и фосфатидилхолин, в то время как отрицательно заряженные фосфолипиды структурированы на внутреннем лепестке мембранного бислоя. У апоптотирующих клеток эта мембранная асимметрия нарушается, и они экспрессируют наружу фосфатидсерин, который распознается специфическим макрофагальным рецептором (Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992).

Следует отметить, что тип распознавания апоптотирующих клеток макрофагами может сильно зависеть от типа клеток и от стадии процесса программированной гибели (Исаева М.П. и соавт.,1998).

1.3.4. Гены, участвующие в апоптозе

Некоторые гены важны для программирования клеток к гибели, другие необходимы для окончательного удаления мертвых клеток и, наконец, четыре гена непосредственно участвуют в процессе апоптоза (Akbar A. N. e. a., 1993).

Продукт гена nuc-1 является эндонуклеазой, расщепляющей ДНК в мертвых клетках. Клетки с мутацией в nuc-1 погибают без деградации ядерной ДНК. Неизвестно существует ли сходство между продуктом nuc-1 и Са^2Мg^2зависимой нуклеазой (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961).

Два гена- ced-3 и ced-4- необходимы для клеточной гибели. При мутациях в этих генах клетки, обычно запрограммированные на гибель, выживают. Показано, что ced-3 является протеазой, а ced-4 содержит Са^2Мg²связывающий домен. ced-9 кодирует белок, предотвращающий гибель клеток, индуцированную ced-3 и ced-4 (Akbar A. N. e. a., 1993,).

1.3.5. Необходимость изучения апоптоза

Отметим ряд наиболее важных для фармакологии направлений для изучения апоптоза.

Во-первых, поиск и разработка препаратов, угнетающих апоптоз. Клиническую перспективность могут иметь препараты, блокирующие апоптоз, индуцированный некоторыми вирусами и суперантигенами. Очевидно, что такие антиапоптотические препараты будут представлять собой первый класс иммуностимуляторов. Теоретически, ингибиторы апоптоза пригодны для лечения ряда нейродегенеративных заболеваний, таких как рассеянный склероз, инсульт, травмы мозга, инфаркт миокарда (Marmur J.,1961). Индукторы апоптоза необходимы прежде всего для лечения злокачественных новообразований, аутоиммунных расстройств (Исаева М.П. и соавт.,1998). Особый интерес представляют исследования, касающиеся изучения процессов запрограммированной клеточной гибели при ИМ. Исследование морфологии и анализ ДНК Т-лимфоцитов позволили установить, что вирусный интерлейкин-10 (продукт репликации EBV) ингибирует потерю клетками объема, уплотнение хроматина и фрагментацию ДНК, характеризующие апоптоз (Taga H. e. a., 1994; T. Uehara e. a., 1992), напротив, при остром ИМ было зарегистрировано повышение Т-клеток с признаками апоптоза. Известно, что некоторые цитокины типа интерлейкинов 2, 5, 6 могут препятствовать апоптозу Т-лимфоцитов (Исаева М.П. и соавт.,1998). Исходя из этого, авторы предположили, что апоптотическая гибель большинства Т-лимфоцитов была связана с их миграцией из участков, активно продуцирующих данные факторы, в результате антигенного воздействия, то есть апоптоз Т-клеток представляется авторами как механизм антигенуправляемой селекции лимфоцитов (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В.,1996; Marmur J.,1961). Увеличение числа апоптотических Т-лимфоцитов (APS) при ИМ также наблюдали Y. Matsuoka e. a. (1997). Уровень APS повышался на ранней стадии ИМ и нормализовался с уменьшением числа атипичных лимфоцитов. Авторы предполагают, что апоптоз Т-клеток при ИМ способствует восстановлению части поврежденных вирусом В-лимфоцитов (Taga H. e. a. , 1994).

Wagner e. a. (1995) показано, что стимуляция апоптоза в EBV-преобразованных лимфоцитах осуществляется Т-лимфоцитами, экспрессирующими BLT-экстеразу. Защиту В-лимфоцитов от апоптотической гибели обеспечивают экспрессируемые ими мембранные белки -LMP1 и BHRF1, кодируемые EBV (Исаева М.П. и соавт.,1998). Защита осуществляется через регуляцию bcl-2-экспрессии лимфоцитами. Bcl-2 proto-oncogen кодирует внутренние митохондриальные белки, блокирующие запрограммированную гибель клеток, в связи с чем регулирование LMP1 и BHRF1 экспрессии. bcl-2 определяет живое состояние и гибель клетки. LMP1 предотвращает апоптоз, индуцируемый анти-fas-антителами, а BHRF1- анти-Pa8-антителами и TNF- (Akbar A. N. e. a., 1993).

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что апоптоз при ИМ служит механизмом, регулирующим численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Таким образом, ИМ- доброкачественное лимфопролиферативное заболевание, достоверным диагностическим критерием которого являются изменения в системе крови. Своеобразным маркером заболевания служат “атипичные мононуклеары”, представляющие собой трансформированные под действием вирусных антигенов лимфоидные клетки. Одним из механизмов ограничения лимфопролиферативности процесса при ИМ является апоптоз, который регулирует численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях инфекционного процесса.

Однако литературные данные, касающиеся апоптотических реакций клеток в норме и при патологическом состоянии, и при ИМ в частности, немногочисленны и фрагментарны, что и послужило причиной настоящего исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материал и объект исследования

Нами были обследованы дети, в возрасте от 7 до 14 лет, больные ИМ (инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр) средней степени тяжести, острым и гладким течением и ОИЗ с МПС (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом герпеса, иерсиниоз, различные формы ангин-фоликулярная, лакунарная, некротическая) в период развернутой клинико-гематологической картины заболевания (1 группа больных), в период реконвалесценции (2 группа больных) и в катамнезе (3 группа больных). Диагноз заболевания устанавливали по характерной клинико-гематологической картине заболевания и лабораторным данным. Диагноз ИМ во всех случаях подтверждали выявлением в сыворотке больных ДНК вируса Эпштейна-Барр методом полимеразной цепной реакции (отдел молекулярной биологии ЦНИЛ СГМУ) и антител к антигену вируса Эпштейна-Барр (Ig A, M, G к вирусному капсидному антигену, Ig G к раннему антигену) с помощью непрямой иммунофлюоресценции (лаборатория онковирусологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН).

Все дети, больные ИМ находились на лечении в инфекционных отделениях в 3 горбольницы г.Томска и в больницы им. Г.Е.Сибирцева.

Контрольную группу составили условно здоровые дети аналогичного возраста. Материал исследования – периферическая кровь. Забор крови осуществляли из локтевой вены, утром, натощак.

Распределение обследованных детей в зависимости от методов и сроков исследования можно наблюдать в табл. 1.

2.2. Исследование апоптоза лимфоцитов

2.2.1. Индукция апоптоза лимфоцитов in vitro

В пробирку вносили 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови( 25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко, не содержащего Ca^2 и Mg^2(‘Sigma’, США). Контролем служила суспензия, состоящая из 0,4 мл плазмы гепаринизированной крови(25 Ед/мл) и 2 мл солевого раствора Дульбекко с 10 % ЭТС. Пробы инкубировали при 37 С в течение 6 часов.

2.2.2. Выделение ДНК лимфоцитов

1. В чистые полипропиленовые пробирки типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл вносили 3 мкл носителя и 450 мкл денатурирующего раствора. Д